Metschnikowia pulcherrima Maya Türünde Tür İçi Varyasyonun Belirlenmesine ITS1 ve ITS2 Bölgelerinin Etkisi


TURGUT GENÇ T. , Günay M., Servili B.

Trakya Üniversiteler Birliği Lisansüstü Öğrenci Kongresi, Çanakkale, Türkiye, 29 - 30 Nisan 2016, cilt.1, no.1, ss.1

  • Cilt numarası: 1
  • Basıldığı Şehir: Çanakkale
  • Basıldığı Ülke: Türkiye
  • Sayfa Sayıları: ss.1

Özet

Maya türlerinin tanımlanmasında klasik yöntemler ve kit sistemleri uzun yıllardır kullanılmaktadır. Son yıllarda moleküler biyoloji alanında meydana gelen gelişmeler ile birlikte maya türlerinin tanımlanmasında çeşitli moleküler yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin başında ribozomal DNA (rDNA) genlerinin dizi analizleri gelmektedir. Eukaryotik canlılarda rDNA genleri tekrarlı transkripsiyonel ünitelerden oluşan diziler halinde organize olmaktadır. Mayalarda her bir transkripsiyon ünitesi ise 18S, 5.8S ve 28S rRNA bölgeleri ile bu bölgeleri ayıran ara dizilerden (ITS1, ITS2, ETS1 ve ETS2) oluşmaktadır. Özellikle 5’-ITS1-5.8S-ITS2-3’ rDNA bölgesi türler arasındaki farlılıkların belirlenmesinde ve filogenetik ilişkilerin ortaya çıkartılmasında kullanılmaktadır. Çalışmamızın amacı ITS1 ve ITS2 bölgelerinden hangisinin tür içi varyasyonun belirlenmesinde ve filogenetik ağların oluşturulmasında daha etkin olduğunu belirlemektir.

Çalışmamızda daha önceki araştırmalarımız sırasında meyvelerden izole edilerek tanımlanan 4 Metschnikowia pulcherrima maya türü ile NCBI veri tabanında 11 farklı kaydedilen 63 M. pulcherrima maya türü kullanıldı. Maya türlerine ait ITS1-5.8S-ITS2 bölgelerinin dizilerini ve tanımlama bilgilerini içeren yeni bir veri tabanı oluşturuldu. Yalnızca ITS1 (~60 bp) bölgesinin dizisini elde etmek için bir tanesi 18S bölgesinin sonunda (CAS I: 5’- TCATTA -3’) diğeri 5.8S bölgesinin başında (CAS II: 5’- AAACTTTCA -3’) olmak üzere iki nükleotid dizi kaseti oluşturuldu. Benzer şekilde ITS2 (~94 bp) bölgesinin dizisini elde etmek için bir tanesi 5.8S bölgesinin sonunda (CAS III: 5’- GATATTT 3’) diğeri ise 26S bölgesinin başında (CAS IV: 5’- TACCCGCTG -3’) olmak üzere iki nükleotid dizi kaseti oluşturuldu. Kaset dizileri Saccharomyces cerevisiae ve M. pulcherrima maya türleri de dahil olmak üzere 10 farklı maya türünün 18S, 5.8S ve 26S rDNA bölgelerinin dizi analizleri yapılarak oluşturuldu. Kasetler arasında kalan 29 maya türüne ait ITS1 ve ITS2 bölgesi varyasyon analizi için kullanılırken kaset aralığında yer almayan 34 ITS1 ve ITS2 dizileri ile ait oldukları M. pulcherrima maya türleri daha sonraki analizlerde kullanılmadı. M. pulcherrima maya türüne ait 29 ITS1 ve ITS2 nükleotid dizileri MEGA 6.0 programı kullanılarak analiz edildi ve tür içi filogenetik ağaç oluşturuldu.

Çalışmamız sonucunda M. pulcherrima maya türlerinin ITS1 bölgelerinin ITS2 bölgelerinden daha çok varyasyona sahip oldukları tespit edildi. Bu durum tür içi farklılıkların belirlenmesinde ve filogenetik ağların tespitinde yalnızca ITS1 bölgesinin kullanılmasının daha uygun olduğunu göstermektedir. Ayrıca NCBI veri tabanına yüklenen nükleotid dizilerinin eksik olduğu ve aynı bölgeye ait dizilerin analizleri arasında dahi büyük farklılıkların olduğu belirlendi. Bu durum NCBI veri tabanına yüklenen dizilerin ve veri tabanının güvenilirliğinin tekrar sorgulanması gerektiğini göstermektedir.

Traditional methods and kit systems have been using identification of yeast species for long time. As well as advances in molecular biology various molecular methods have been developed for identifying yeast species. Sequence analysis of Ribosomal DNA (rDNA) genes was used commonly in these methods. Eukaryotic rDNA genes are organized as an array of tandem repeating transcriptional units. Each transcription unit in yeast species consist of 18S, 5.8S and 26S rRNA regions with their intergenic spacers (ITS1, ITS2, ETS1 and ETS2). Especially, 5’- ITS1-5.8S-ITS2 -3’ rDNA region have been used in determination of intraspecific variations and phylogenetic relations among species. The purpose of our research was to analyze the ITS1 and ITS2 regions and to specify which one is more significative for determining the intraspecific variations and phylogenetic relations.

For this purpose 4 M. pulcherrima species, isolated and identified in our previous works, and 59 M. pulcherrima species submitted to NCBI database from 11 different countries were used. A new data base including ITS1-5.8S –ITS2 gene sequences belonging to 63 M. pulcherrima species was formed. Two nucleotide sequence cassette were constructed to obtain exact ITS1 (~ 60bp) sequence. One of these cassettes are localized at the end of the 18S region (CAS I: 5’-TCATTA -3’) and other one localized at the start of 5.8S region (CAS II: 5’- AAACTTTCA -3’). Similarly, for obtaining exact ITS2 (~ 94bp) sequence two additional DNA cassettes were constructed which are located at the end of the 5.8S region (CAS III: 5’-GATATTT -3’) and at the start of 26S region (CAS VI: 5’- TACCCGCTG -3’).  For constructing DNA cassettes sequence analysis of 18S, 5.8S and 26S rDNA gene regions of 10 different yeast species including Saccharomyces cerevisiae and M. pulcherrima were used. By using 4 cassettes, 29 intact ITS1 and ITS2 sequences were obtained and used in further analysis and 34 ITS1 and ITS2 sequences were eliminated because of missing sequences. ITS1 and ITS2 nucleotide sequences of 29 M. pulcherrima species were analyzed and intraspecific phylogenetic tree were constructed by using MEGA 6.0 programme.

In our research we identify that ITS1 regions show high variations than ITS2 regions in M. pulcherrima species. And so that ITS1 regions are suitable for determining intraspecific variations and phylogenetic networks. Furthermore, it was determined that the most of the sequences submitted to NCBI are incomplete, and many differences present between the nucleotide sequences of same regions. This situation shows that the reliability of NCBI database should be queried.