Recombinant production of a glycosidase by using an in-vivo cloning system and its immobilization via different strategies
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi, Lisansüstü Eğitim Enstitüsü, BİYOMOLEKÜLER BİLİMLER ANABİLİM DALI, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2020
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: BURCU PEKDEMİR
Danışman: Sercan Karav
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:İnsan sütü su hariç %54 laktoz, %32 yağ, %8 serbest oligosakkaritler (serbest glikanlar) ve %6 protein içermektedir. Serbest glikanlar insan sütünde yüksek miktarda bulunmasına rağmen, bu glikanların bebekler tarafından sindirilmesi mümkün değildir. Bir araştırmada, bu bileşiklerin aslında faydalı bakterilerin gelişiminde ve dolayısıyla bebeklerin bağışıklık sistemini güçlendirmede kullanıldığı gösterilmiştir (Lo Cascio ve diğerleri, 2007). Serbest glikanların çok değerli bir prebiyotik kaynağı olduğunun anlaşılmasından sonra, bu bileşiklere olan ilgi hızla artmıştır ve önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir. Anne sütünün endüstriyel anlamda üretilme olanağının çok sınırlı olması ve serbest glikanların diğer sütlerdeki oranının (inek sütü % 0.1) oldukça düşük olması nedeniyle, anne sütüne erişim olanağı olmayan bebeklere, serbest glikanların temini konusunda çok ciddi bir açık bulunmaktadır. Bu eksikliği gidermek amacı ile araştırmacılar kimyasal yapıca glikan özelliği gösterebilecek başka bileşiklerin keşfine yönelmiştir ve serbest glikanlara oldukça benzer başka bileşiklerin proteinlere N- ve O-glikosidik bağlarla bağlı şekilde (glikoproteinler) bulunduğunu göstermişlerdir. Glikanlar, prebiyotik etkileri yanında, hücreler arası etkileşimde, proteinlerin düzgün bir şekilde katlanmasında ve stabilizasyonunda da önemlidir. Fakat glikanların bu biyolojik ve fiziko-kimyasal özellikleri, glikoproteinlerden ayrılmaları için kullanılan yöntemlerin yetersizliği yüzünden tam olarak anlaşılamamıştır. Günümüzde kullanılan kimyasal ve enzimatik yöntemler, bütün glikanları glikoproteinlerden ayıramamakta ya da bu yöntemler güçlü kimyasal ve ısı kullanımı gerektirdiğinden, glikanların ve geride kalan protein kısmının yapısını bozmaktadır. Bu eksikliği gidermek için yeni bir enzim olan endo-β-N- asetilglukozaminidaz, Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697'dan ilk 2015 yılında izole edilmistir (Karav ve diğerleri, 2015a). Bu enzim herhangi bir ısıl işleme ve kimyasal kullanımına gereksinim duymadan, glikanların biyolojik etkinliği kaybolmadan izole edilmesine olanak sağlamaktadır. Bu yüzden günümüzde glikanların yüksek ölçüde izole edilip biyolojik görevlerinin araştırılmasına olanak sağlayan tek strateji olarak bu enzimin kullanımı kabul edilmektedir. Bu tez çalışmasında ilk olarak, ticari olarak temini mümkün olmayan endo-β-N-asetilglukozaminidaz enziminin rekombinant olarak üretilmesi hedeflenmiştir. Bu enzimi kodlayan genin moleküler klonlaması için yeni bir teknik olan in-vivo klonlama tekniği kullanılmıştır ve farklı immobilizasyon stratejileri (adsorpsiyon, hapsedilme ve kovalent bağlama) denenerek enzimin geri kazanımının sağlanması hedeflenmiştir. Elde edilen immobilize enzimlerin aktiviteleri model terapötik proteinler üzerinde denenmiş ve serbest enzimden sonra en yüksek aktivite gösteren enzim formunun adsorbsiyon stratejisi ile immobilize edilen enzim olduğu görülmüştür. Daha sonra elde edilen glikanlar ileri kütle spektrometresi kullanılarak karakterize edilmiştir. Uzun süreli inkübasyon sonucunda, farklı stratejiler ile immobilize edilen enzimlerin bütün N-bağlı glikanları kesebildiği gösterilmiştir.