Recombinant production and characterization of new bifidobacterial glycosidases
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi, Lisansüstü Eğitim Enstitüsü, Molecular Biology and Genetics, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2021
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: BERFİN SUCU
Danışman: Sercan Karav
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Protein glikozilasyonu, protein katlanması, stabilitesi ve enzimatik koruma dahil olmak üzere protein fonksiyonu gibi önemli rollerle ilişkilendirilmiş yaygın bir translasyon sonrası modifikasyondur. Glikoproteinler (laktoferrin, immünoglobulinler gibi), protein ve glikan ikilisinden oluşmaktadır. Bakteriler, glikoproteinleri sindirebilecek gerekli enzimleri içermediğinden onları karbon kaynağı olarak kullanamaz. Bundan dolayı bakteriler üzerinde gözlemlenen gelişimin karbon kaynağı glikanlardır. Glikanların glikoproteinlerden ayrılıp hücre içine alınabilmesi için ise önce bakterilerin glikosidazlarının bu glikanları kesmeleri gerekmektedir. Glikoproteinlere bağlanan N-glikanlar, konakçı tarafından sindirilemez ve bazı yararlı bakteriler tarafından tüketildikleri kalın bağırsağa ulaşır. Bu nedenle, bağırsak mikrobiyomundaki yararlı mikroorganizmaları seçici bir şekilde uyarabilen yeni nesil prebiyotik bileşikler olarak kabul edilirler. Bifidobakteriler, N-glikan salınımı için benzersiz bir genomik yeteneğe sahiptir. Bu tez kapsamında, glikoproteinlerden N-glikan salınımı için farklı organizmalardan (bebekler, tavşanlar, tavuklar ve yaban arıları) izole edilen Bifidobakteri suşlarından yeni glikosidazların rekombinant üretimi amaçlanmıştır. İlk olarak, Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697'den izole edilen endo-β-N-asetilglukozaminidaz enziminin amino asit dizisine benzerlikleri açısından farklı Bifidobakteri suşlarından yeni glikosidazlar seçilmiştir. Bu enzimlere genetiksel olarak farklı füzyon etiketler (N-His, SUMO, C-His) eklenmiştir ve enzimleri kodlayan genlerin klonlaması için E. cloni 10G hücrelerinde in vivo klonlama tekniği kullanılmıştır. Hedef glikanları değiştirilen enzimler batch methodu ile yüksek verimde üretilmiş ve saflaştırılmıştır. Ardından saflaştırılan enzimlerin model protein RNase B üzerindeki aktiviteleri SDS-PAGE analiziyle test edilmiştir ve aktivite gösteren beş enzimin optimum reaksiyon koşulları ve kinetik parametreleri belirlenmiştir.